Cell：補齊基因編輯最后缺口 開啟線粒體基因編輯新時代

從1968年第一個限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)、到1985年聚合酶鏈式反應（PCR）技術的發(fā)明，再到2013年 CRISPR 基因編輯技術的應用，生物技術的每一個突破性發(fā)現(xiàn)都進一步提高了我們操縱 DNA，乃至調(diào)控生命藍圖的能力。特別是 CRISPR 基因編輯技術的成功應用，讓我們能以前所未有的效率對活細胞和個體進行全面的基因編輯，也讓我們能夠治療之前無能為力的遺傳疾病。

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基因編輯技術在細胞核基因組的編輯中取得了輝煌的成績，但是在線粒體基因組編輯中卻滯后很多。線粒體（mitochondrion）是細胞的“能量工廠”，線粒體內(nèi)有一套獨立于細胞核的遺傳物質(zhì)——線粒體DNA（mtDNA），人類線粒體 DNA 的長度為16569bp，擁有37個基因，編碼13種蛋白，這些蛋白都參與細胞的能量代謝。

由于線粒體在能量穩(wěn)態(tài)中的重要作用，線粒體 DNA 中的點突變就可導致發(fā)育障礙、神經(jīng)肌肉疾病、癌癥進展等等多種嚴重疾病。目前 線粒體 DNA 中有90個已知的致病點突變，約5000人中就有1人患病。

然而，由于靶向線粒體的遞送方法的限制，使得現(xiàn)有的基因組編輯工具難以應用，例如基于 CRISPR 的基因編輯工具，因為 gRNA 無法有效導入線粒體，導致其無法編輯線粒體 DNA。

此外，因為缺乏線粒體基因編輯工具，也導致了現(xiàn)在非常缺乏研究線粒體 DNA 突變的動物模型，這極大地限制了對線粒體遺傳病的研究和治療。

因此，開發(fā)針對線粒體 DNA 的基因編輯工具一直是線粒體遺傳學領域的長期目標。在線粒體 DNA 中精確誘導堿基突變，有助于解釋這些突變在發(fā)病機制中的作用，也可作為相應的治療方法。

2022年4月25日，韓國基礎科學研究院金鎮(zhèn)秀（Jin-Soo Kim）團隊在 Cell 發(fā)表了題為：Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases 的研究論文。

該研究開發(fā)了一種新型線粒體堿基編輯平臺——轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物連接的脫氨酶（TALED），首次實現(xiàn)了在線粒體中進行 A to G 的堿基轉(zhuǎn)換，為基因編輯補上了最后一塊缺失的拼圖。大大擴展了當前對線粒體基因編輯的范圍，不僅可以用于建立線粒體疾病模型，還可以用來治療線粒體遺傳疾病。

對線粒體 DNA 進行可靠的基因編輯，是現(xiàn)代基因組工程最后未完全攻破的堡壘之一，世界上許多優(yōu)秀的科學家多年來一直致力于解決這個難題。

2020年8月，劉如謙團隊在 Nature 發(fā)表論文，他開發(fā)了一種不依賴 CRISPR 的堿基編輯器——DdCBE，能夠?qū)崿F(xiàn)對線粒體 DNA 的精準編輯，為研究線粒體遺傳病和治療線粒體遺傳病帶來了前所未有的工具。
但這一工具也有其局限性，只能對線粒體 DNA 進行 C-to-T 轉(zhuǎn)換，實際上，只能高效地進行 TC to TT 轉(zhuǎn)換，這意味著該工具只能編輯現(xiàn)在已知的90個線粒體 DNA 點突變中的9個，對其他90%的線粒體 DNA 點突變無能為力。

2022年4月4日，劉如謙團隊在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表論文，對其兩年前開發(fā)的線粒體堿基編輯器 DdCBE 進行了重要升級，提高了編輯效率和序列編輯范圍，能對TC、AC、CC位點進行更高效的編輯。

但仍未實現(xiàn)線粒體 DNA 中 A to G 的轉(zhuǎn)換。

在這篇 Cell 論文中，研究團隊創(chuàng)建了一個名為 TALED 的新型線粒體基因編輯平臺，可以實現(xiàn)線粒體 DNA 的 A-to-G 轉(zhuǎn)換。值得注意的是，僅在人類線粒體 DNA 中進行 A to G 轉(zhuǎn)換就可以糾正90個已知線粒體點突變中的39個（43%）。TALED 極大地擴展了線粒體基因編輯的范圍，不僅可以用于建立線粒體疾病模型，還可以用來治療線粒體遺傳疾病。

研究團隊通過融合三個不同組分創(chuàng)建出了 TALED，第一個組分是轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物（TALE），它能夠靶向 DNA 序列；第二個組分是 TadA8e，這是一種促進 A to G 轉(zhuǎn)換的腺嘌呤脫氨酶；第三個組分是 DddAtox，這是一種胞嘧啶脫氨酶，它使 TadA8e 更容易接近 DNA。

TadA8e 此前被認為是一種只對單鏈 DNA 具有特異性的脫氨酶，因此沒人想要使用它來進行基因編輯，但這項研究顯示，TadA8e 能夠在具有雙鏈 DNA 的線粒體中進行 A to G 轉(zhuǎn)換。

該研究的通訊作者金鎮(zhèn)秀（Jin-Soo Kim）表示：正是這種跳出框框的思維方式真正幫助我們發(fā)明了 TALED。 DddAtox 能夠瞬時打開雙鏈 DNA，這個轉(zhuǎn)瞬即逝的時間窗口，足以使超速效酶 TadA8e 快速進行 A to G 轉(zhuǎn)換，編輯效率高達49%。此外，研究團隊還開發(fā)了能夠同時進行 A-to-G 和 C-to-T 轉(zhuǎn)換以及僅 A-to-G 轉(zhuǎn)換的編輯工具。
研究團隊進一步驗證了該工具的安全性，他們發(fā)現(xiàn) TALED 既沒有細胞毒性，也不會導致線粒體 DNA 不穩(wěn)定。此外，沒有對細胞核 DNA 造成不良脫靶編輯，mtDNA 中的脫靶編輯也很少。

最后，研究團隊表示，接下來的目標是提高 TALED 的編輯效率和特異性，為最終在胚胎、胎兒、嬰兒或成年患者中編輯引起疾病的線粒體基因突變鋪平道路。此外，研究團隊還在開發(fā)適用于植物葉綠體 DNA 中 A to G 轉(zhuǎn)換的 TALED，用來改善植物的光合作用效率。

撰文 | 王聰

編輯 | 王多魚

排版 | 水成文

論文鏈接：

1.https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)00389-0

2.https://www.nature.com/articles/s41586-020-2477-4

3.https://www.nature.com/articles/s41587-022-01256-8

關鍵詞： Cell補齊基因編輯最后缺口 開啟線粒體基因